Multiplex Digital PCR (dPCR) stanowi znaczący postęp w dziedzinie biologii molekularnej, oferując wyraźne zalety w porównaniu z tradycyjną reakcją łańcuchową polimerazy (PCR). Jako dostawca rozwiązań Multiplex Digital PCR jestem podekscytowany możliwością zagłębienia się w różnice między tymi dwiema technologiami i podkreślenia wyjątkowych korzyści, jakie wnosi Multiplex Digital PCR.
Zasady tradycyjnego PCR i multipleksowego cyfrowego PCR
Tradycyjna PCR jest dobrze ugruntowaną techniką stosowaną do amplifikacji określonych sekwencji DNA. Polega na wykładniczej amplifikacji docelowego DNA przy użyciu starterów, polimerazy DNA i nukleotydów. Reakcja zachodzi w pojedynczej probówce, a wzmocnienie jest monitorowane w czasie rzeczywistym lub w punkcie końcowym. Ilość amplifikowanego DNA szacuje się na podstawie wartości progu cyklu (Ct) w reakcji PCR w czasie rzeczywistym, czyli liczby cykli, podczas których sygnał fluorescencji przekracza wcześniej określony próg.
Z drugiej strony, Multiplex Digital PCR dzieli próbkę na tysiące lub miliony pojedynczych reakcji. Każda przegroda pełni funkcję niezależnej minikomory reakcyjnej. Próbkę rozcieńcza się w taki sposób, że niektóre partycje zawierają docelową cząsteczkę DNA, a inne nie. Po amplifikacji partycje analizuje się w celu określenia obecności lub braku docelowego DNA. Licząc liczbę dodatnich i ujemnych podziałów, można obliczyć bezwzględną ilość docelowego DNA, stosując statystykę Poissona.
Precyzja i czułość
Jedna z najbardziej znaczących różnic pomiędzy multipleksową cyfrową PCR a tradycyjną PCR polega na ich precyzji i czułości. Tradycyjna PCR jest metodą półilościową, co oznacza, że może zapewnić jedynie względną ocenę ilościową docelowego DNA. Na wartość Ct wpływają różne czynniki, takie jak wydajność reakcji PCR, jakość próbki i obecność inhibitorów. Może to prowadzić do zmienności wyników, szczególnie przy porównywaniu próbek z różnych źródeł lub warunków eksperymentalnych.
Jednakże Multiplex Digital PCR umożliwia bezwzględną ocenę ilościową. Ponieważ zlicza liczbę dodatnich i ujemnych przegród, nie ma to wpływu na wydajność reakcji. Dzięki temu jest bardzo precyzyjny, nawet przy niskich stężeniach docelowych. Na przykład w zastosowaniach takich jak wykrywanie rzadkich mutacji lub pomiar transkryptów o niskiej liczebności, Multiplex Digital PCR może wykryć cele, które mogą zostać przeoczone w tradycyjnej PCR.
Możliwość multipleksowania
Kolejną kluczową różnicą jest możliwość multipleksowania. Tradycyjna PCR może zazwyczaj amplifikować tylko jeden lub kilka celów w pojedynczej reakcji. Dzieje się tak dlatego, że startery i sondy stosowane do różnych celów mogą wzajemnie zakłócać się, prowadząc do nieswoistej amplifikacji lub zmniejszonej wydajności.
Multiplex Digital PCR, jak sama nazwa wskazuje, może jednocześnie wykryć wiele celów w jednej reakcji. Osiąga się to poprzez zastosowanie różnych barwników fluorescencyjnych dla każdego celu. Każdą partycję można następnie analizować pod kątem obecności różnych celów w oparciu o sygnał fluorescencji. Ta funkcja multipleksowania jest szczególnie przydatna w zastosowaniach takich jak profilowanie ekspresji genów, wykrywanie patogenów i analiza biomarkerów nowotworowych, gdzie należy wykryć wiele celów jednocześnie.
Tolerancja na inhibitory
Tradycyjna PCR jest bardzo wrażliwa na obecność inhibitorów w próbce. Inhibitory mogą zmniejszać skuteczność reakcji PCR, prowadząc do fałszywie ujemnych wyników lub niedokładnego oznaczenia ilościowego. Inhibitory te mogą być obecne w próbkach biologicznych, takich jak krew, tkanki lub próbki środowiskowe.
Multiplex Digital PCR jest bardziej tolerancyjny na inhibitory. Ponieważ próbka jest podzielona na wiele małych reakcji, działanie inhibitorów jest osłabione. Nawet jeśli inhibitory wpływają na niektóre partycje, partycje nienaruszone mogą nadal zapewniać dokładną ocenę ilościową docelowego DNA. Dzięki temu Multiplex Digital PCR jest bardziej niezawodną techniką analizy złożonych próbek.
Aplikacje
Różnice pomiędzy multipleksową cyfrową PCR a tradycyjną PCR przekładają się również na różne zastosowania. Tradycyjna PCR jest szeroko stosowana w rutynowych zastosowaniach biologii molekularnej, takich jak klonowanie genów, genotypowanie i podstawowa analiza ekspresji genów. Jest to opłacalna i stosunkowo prosta technika wykrywania i amplifikacji DNA.
Z drugiej strony, multiplex Digital PCR jest szczególnie przydatny w zastosowaniach wymagających dużej precyzji i czułości. Na przykład w badaniach nad rakiem można go zastosować do wykrywania rzadkich mutacji somatycznych w próbkach nowotworów. W diagnostyce chorób zakaźnych można go stosować do wykrywania patogenów o niskim poziomie w próbkach klinicznych. W monitorowaniu środowiska może być stosowany do wykrywania i oznaczania ilościowego mikroorganizmów w próbkach wody lub gleby.
Nasze rozwiązania Multiplex Digital PCR
Jako dostawca rozwiązań Multiplex Digital PCR oferujemy szeroką gamę produktów wysokiej jakości, aby sprostać różnorodnym potrzebom naszych klientów. NaszCyfrowy system PCR z kroplami D3200 (tylko Chiny)to najnowocześniejszy instrument zapewniający dokładne i wiarygodne cyfrowe wyniki PCR. Charakteryzuje się wysoką przepustowością, umożliwiając jednoczesną analizę wielu próbek.
TheAD3207 Zautomatyzowany cyfrowy system PCR z kroplamito zautomatyzowane rozwiązanie, które usprawnia przepływ pracy w cyfrowej reakcji PCR. Redukuje czas pracy i błędy ludzkie, dzięki czemu idealnie nadaje się do laboratoriów o dużym natężeniu ruchu.
NaszPilot1200 Wszystko w jednym cyfrowym urządzeniu do PCRto kompaktowy i przyjazny dla użytkownika instrument, który łączy w sobie wszystkie niezbędne funkcje do cyfrowej analizy PCR. Nadaje się zarówno do zastosowań badawczych, jak i klinicznych.
Wniosek
Podsumowując, Multiplex Digital PCR oferuje kilka zalet w porównaniu z tradycyjnym PCR, w tym wyższą precyzję, lepszą czułość, zdolność multipleksowania i większą tolerancję na inhibitory. Cechy te czynią go potężnym narzędziem do szerokiego zakresu zastosowań w biologii molekularnej, medycynie i naukach o środowisku.
Jeśli są Państwo zainteresowani dodatkowymi informacjami na temat naszych rozwiązań Multiplex Digital PCR lub chcieliby Państwo omówić swoje specyficzne potrzeby, zachęcamy do skontaktowania się z nami w celu konsultacji zakupowej. Nasz zespół ekspertów jest gotowy pomóc Ci w znalezieniu najlepszego rozwiązania dla Twoich potrzeb badawczych lub diagnostycznych.
Referencje
- Hindson, BJ, Ness, KD, Masquelier, DA, Belgrader, P., Heredia, NJ, Makarewicz, AJ,… i Efcavitch, JW (2011). Wysokoprzepustowy, cyfrowy system PCR metodą kropelkową do bezwzględnego oznaczania ilościowego liczby kopii DNA. Chemia analityczna, 83(22), 8604 - 8610.
- Vogelstein, B. i Kinzler, KW (1999). Cyfrowa PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96(16), 9236 - 9241.
- Pinheiro, JB i Scherer, SE (2012). Digital PCR: nowa technologia umożliwiająca bardziej czułą diagnostykę molekularną. Ekspertyza diagnostyki molekularnej, 12(5), 507 - 516.
